Геном человека
Расшифровка генома человека и животных внесла огромный вклад в эндокринологию. Этому в значительной степени способствовала разработка методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования ДНК. Выяснилось, что в геноме человека присутствует около 30000 генов, и что дополнительное разнообразие в структуру белков вносит альтернативный процессинг РНК и использование разных промоторов. Имеющиеся данные свидетельствуют, например, о том, что у человека синтезируется всего 48 различных ядерных рецепторов, тогда как раньше считали, что их количество достигает 600. Секвенирование ДНК облегчают изучение регуляции генов и изменения их последовательности при разных заболеваниях. Сравнение последовательности участков ДНК у разных видов животных позволяет понять эволюцию механизмов эндокринной регуляции.
Геномика и профили транскрипции
Геномика позволяет широко изучать транскрипцию генов. В большинстве исследований используют так называемые микрочипы — небольшие стеклянные или силиконовые пластинки, им- прегнированные кДНК или олигонуклеотидами, соответствующими нескольким отобранным (менее 100) или многим (более 20000) генам. Посредством стандартных методов гибридизации микрочипы «зондируют» мечеными ДНК, комплементарными РНК анализируемых клеток или тканей. Такой анализ позволяет получить общее представление об относительном содержании разных мРНК в клетках или тканях. При этом можно сравнивать контрольные и стимулированные гормонами ткани и клетки, а также близкие и различные ткани. Полученные сведения используются для идентификации отдельных генов (или генных семейств), играющих важную роль в тех или иных реакциях на гормоны. Кроме того, это способствует выяснению функциональных связей между различными генами и возможных мишеней для новых лекарств. Данная технология позволяет также установить влияние специфического сигнала на кластеры функционально связанных генов (например, генов клеточного цикла, метаболических путей, реакций на стресс), что имеет важное клиническое значение. Так, степень злокачественности опухолей молочной железы и их чувствительности к гормонам можно типировать в соответствии с общим профилем экспрессии генов этой ткани. Например, коэкспрессия ЭР и поверхностного рецептора HER2/neo, сопряженная с амплификацией гена белка-коактиватора AIB1, свидетельствует о резистентности опухоли молочной железы к тамокси- фену. Другие профили генной экспрессии в таких опухолях могут помочь выбору более или менее агрессивной терапии. Вполне вероятно, что в ближайшем будущем данная технология станет рутинным способом анализа биоптатов опухолей и будет способствовать выработке оптимальной стратегии лечения. Помимо этого, такие исследования позволяют обнаружить более тонкие, чем предполагалось ранее, различия в действии даже близких гормонов, что должно оказать глубокое влияние на развитие фармакологии.
ПРОТЕОМИКА
В задачи протеомики входит анализ синтеза, взаимосвязей, активности и строения белков. О синтезе белков можно в определенной степени судить по характеру транскрипции. Однако исследования экспрессии генов не позволяют оценивать ни скорость трансляции или стабильность белков, ни взаимодействия белков или изменения их активности (на что влияют такие факторы, как субклеточная локализация или вторичные модификации). Например, быстрая реакция на пептидные гормоны зависит от регуляции ферментативной активности, локализации белков и их стабильности.
В протеомике используется ряд методов. С помощью масс-спектроскопии можно определить белки, синтезируемые в определенных условиях. Сочетание данного метода с фракционированием белков разных субклеточных структур или обладающих разными биохимическими свойствами позволяет выяснить механизмы, посредством которых синтез и активность белков влияют на проведение гормональных сигналов. Например, можно наблюдать, как в ответ на тот или иной гормональный сигнал происходит накопление, уменьшение количества или транслокация отдельных белков в клеточное ядро. Для выяснения белков, участвующих в проведении сигнала инсулина или опосредующих эффекты киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK), можно использовать антитела, взаимодействующие с фосфопротеинами. Такими способами удается установить природу как отдельных белков, так и их совокупностей, опосредующих конкретную реакцию на гормон.
МАНИПУЛЯЦИИ С ГЕНОМОМ
Современные достижения молекулярной биологии создают возможность манипуляций с генами эндокринных сигнальных путей и оценивать эффекты мутаций. В геноме зародышевых клеток трансгенных животных содержатся экзогенные гены. Подбор соответствующих промоторов обеспечивает синтез или усиленный синтез продуктов этих генов во всех или отдельных тканях животного. Трансгены могут также синтезировать доминантно негативные белки или ингибиторные (интерферирующие) РНК (см. далее), уменьшающие активность генного продукта, или выполнять функцию генов-репортеров, позволяющих in vivo оценивать активность определенных гормон-ре- цепторных комплексов или сигнальных систем. Для удаления («нокаут») или модификации («но- кин») генов в эмбриональных стволовых клетках используют гомологичную рекомбинацию. Модифицированные (содержащие рекомбинантный ген-маркер лекарственной устойчивости) эмбриональные стволовые клетки отбирают и вводят их зародышам мышей в надежде на фиксацию трансгена в половых клетках.
С помощью таких методов можно осуществлять тканеспецифический нокаут генов. Нужный ген замещают сходным, но ограниченным с обеих сторон сайтами рекомбинации (1ох). Если рекомбиназу (сге) удается экспрессировать тканеспецифическим образом (помещая трансген под контроль тканеспецифического промотора), то анализируемый ген будет удален из клеток данной ткани.
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ РНК (RNAI)
Явление РНК-интерференции заключается в том, что короткие (состоящие из 21-25 нуклеотидов) двуцепочечные РНК (дцРНК, или RNAi)
экспрессируются в клетках и подавляют активность генов. Это осуществляется путем гибридизации комплементарных последовательностей RNAi и мРНК, что приводит к деградации последней, блокируя тем самым экспрессию соответствующего гена. Такое эпигенетическое подавление экспрессии генов в клетках животных может служить механизмом защиты от вирусных инфекций и повреждения генома мобильными генетическими элементами. Эта система может функционировать и у человека, поскольку в его геноме содержатся гены, кодирующие короткие РНК, способные образовывать двойные цепи, причем многие из этих транскриптов действительно экспрессируются (иногда в определенные периоды развития или в определенных тканях).
В настоящее время короткие дцРНК широко используют для снижения уровня гомологичных мРНК, что приводит к подавлению синтеза отдельных белков и позволяет исследовать влияние последних на множество параметров — от экспрессии конкретных генов-мишеней до формы, жизнеспособности или размеров клеток. Клетки наслаивают на маленькие чипы, покрытые разными дцРНК. Их поглощение клетками дает возможность наблюдать эффекты устранения многих индивидуальных генных продуктов. Кроме того, короткие RNAi используются и в модельных экспериментах на животных; эти соединения могут экспрессироваться трансгенами и вирусными векторами или даже вводиться в хвостовую вену мышей, откуда они поглощаются печенью.
В будущем не исключено и терапевтическое использование дцРНК. Решение проблемы их доставки в определенные органы должно иметь огромное значение при заболеваниях человека, создавая возможность избирательного подавления экспрессии вредных генов при раке и ряде эндокринных расстройств, связанных с повышенной активностью того или иного гена.