Успехи современной науки и эндокринология. 1 часть

Геном человека

Расшифровка генома человека и животных вне­сла огромный вклад в эндокринологию. Этому в значительной степени способствовала разработка методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования ДНК. Выяснилось, что в геноме человека присутствует около 30000 генов, и что до­полнительное разнообразие в структуру белков вносит альтернативный процессинг РНК и исполь­зование разных промоторов. Имеющиеся данные свидетельствуют, например, о том, что у человека синтезируется всего 48 различных ядерных рецеп­торов, тогда как раньше считали, что их количество достигает 600. Секвенирование ДНК облегчают изучение регуляции генов и изменения их последо­вательности при разных заболеваниях. Сравнение последовательности участков ДНК у разных видов животных позволяет понять эволюцию механиз­мов эндокринной регуляции.

Геномика и профили транскрипции

Геномика позволяет широко изучать транс­крипцию генов. В большинстве исследований ис­пользуют так называемые микрочипы — неболь­шие стеклянные или силиконовые пластинки, им- прегнированные кДНК или олигонуклеотидами, соответствующими нескольким отобранным (менее 100) или многим (более 20000) генам. Посред­ством стандартных методов гибридизации микро­чипы «зондируют» мечеными ДНК, комплемен­тарными РНК анализируемых клеток или тканей. Такой анализ позволяет получить общее представ­ление об относительном содержании разных мРНК в клетках или тканях. При этом можно сравнивать контрольные и стимулированные гормонами ткани и клетки, а также близкие и различные ткани. По­лученные сведения используются для идентифика­ции отдельных генов (или генных семейств), играющих важную роль в тех или иных реакциях на гормоны. Кроме того, это способствует выясне­нию функциональных связей между различными генами и возможных мишеней для новых лекарств. Данная технология позволяет также установить влияние специфического сигнала на кластеры функционально связанных генов (например, генов клеточного цикла, метаболических путей, реакций на стресс), что имеет важное клиническое значе­ние. Так, степень злокачественности опухолей молочной железы и их чувствительности к гормо­нам можно типировать в соответствии с общим профилем экспрессии генов этой ткани. Например, коэкспрессия ЭР и поверхностного рецептора HER2/neo, сопряженная с амплификацией гена белка-коактиватора AIB1, свидетельствует о рези­стентности опухоли молочной железы к тамокси- фену. Другие профили генной экспрессии в таких опухолях могут помочь выбору более или менее аг­рессивной терапии. Вполне вероятно, что в бли­жайшем будущем данная технология станет рутин­ным способом анализа биоптатов опухолей и будет способствовать выработке оптимальной стратегии лечения. Помимо этого, такие исследования позво­ляют обнаружить более тонкие, чем предполага­лось ранее, различия в действии даже близких гор­монов, что должно оказать глубокое влияние на развитие фармакологии.

ПРОТЕОМИКА

В задачи протеомики входит анализ синтеза, взаимосвязей, активности и строения белков. О син­тезе белков можно в определенной степени судить по характеру транскрипции. Однако исследования экспрессии генов не позволяют оценивать ни ско­рость трансляции или стабильность белков, ни взаи­модействия белков или изменения их активности (на что влияют такие факторы, как субклеточная ло­кализация или вторичные модификации). Напри­мер, быстрая реакция на пептидные гормоны зави­сит от регуляции ферментативной активности, ло­кализации белков и их стабильности.

В протеомике используется ряд методов. С по­мощью масс-спектроскопии можно определить белки, синтезируемые в определенных условиях. Сочетание данного метода с фракционированием белков разных субклеточных структур или обла­дающих разными биохимическими свойствами по­зволяет выяснить механизмы, посредством кото­рых синтез и активность белков влияют на прове­дение гормональных сигналов. Например, можно наблюдать, как в ответ на тот или иной гормональ­ный сигнал происходит накопление, уменьшение количества или транслокация отдельных белков в клеточное ядро. Для выяснения белков, участвую­щих в проведении сигнала инсулина или опосре­дующих эффекты киназы, регулируемой внеклеточ­ными сигналами (ERK), можно использовать антитела, взаимодействующие с фосфопротеинами. Такими способами удается установить природу как отдельных белков, так и их совокупностей, опосре­дующих конкретную реакцию на гормон.

МАНИПУЛЯЦИИ С ГЕНОМОМ

Современные достижения молекулярной био­логии создают возможность манипуляций с генами эндокринных сигнальных путей и оценивать эф­фекты мутаций. В геноме зародышевых клеток трансгенных животных содержатся экзогенные гены. Подбор соответствующих промоторов обес­печивает синтез или усиленный синтез продуктов этих генов во всех или отдельных тканях животно­го. Трансгены могут также синтезировать доми­нантно негативные белки или ингибиторные (ин­терферирующие) РНК (см. далее), уменьшающие активность генного продукта, или выполнять функцию генов-репортеров, позволяющих in vivo оценивать активность определенных гормон-ре- цепторных комплексов или сигнальных систем. Для удаления («нокаут») или модификации («но- кин») генов в эмбриональных стволовых клетках используют гомологичную рекомбинацию. Моди­фицированные (содержащие рекомбинантный ген-маркер лекарственной устойчивости) эмбрио­нальные стволовые клетки отбирают и вводят их зародышам мышей в надежде на фиксацию транс­гена в половых клетках.

С помощью таких методов можно осуществлять тканеспецифический нокаут генов. Нужный ген за­мещают сходным, но ограниченным с обеих сторон сайтами рекомбинации (1ох). Если рекомбиназу (сге) удается экспрессировать тканеспецифиче­ским образом (помещая трансген под контроль тка­неспецифического промотора), то анализируемый ген будет удален из клеток данной ткани.

ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ РНК (RNAI)

Явление РНК-интерференции заключается в том, что короткие (состоящие из 21-25 нуклеоти­дов) двуцепочечные РНК (дцРНК, или RNAi)

экспрессируются в клетках и подавляют актив­ность генов. Это осуществляется путем гибридиза­ции комплементарных последовательностей RNAi и мРНК, что приводит к деградации последней, блокируя тем самым экспрессию соответствующе­го гена. Такое эпигенетическое подавление экс­прессии генов в клетках животных может служить механизмом защиты от вирусных инфекций и по­вреждения генома мобильными генетическими элементами. Эта система может функционировать и у человека, поскольку в его геноме содержатся гены, кодирующие короткие РНК, способные обра­зовывать двойные цепи, причем многие из этих транскриптов действительно экспрессируются (иногда в определенные периоды развития или в определенных тканях).

В настоящее время короткие дцРНК широко используют для снижения уровня гомологичных мРНК, что приводит к подавлению синтеза отдель­ных белков и позволяет исследовать влияние по­следних на множество параметров — от экспрессии конкретных генов-мишеней до формы, жизнеспо­собности или размеров клеток. Клетки наслаивают на маленькие чипы, покрытые разными дцРНК. Их поглощение клетками дает возможность наблю­дать эффекты устранения многих индивидуальных генных продуктов. Кроме того, короткие RNAi ис­пользуются и в модельных экспериментах на жи­вотных; эти соединения могут экспрессироваться трансгенами и вирусными векторами или даже вво­диться в хвостовую вену мышей, откуда они погло­щаются печенью.

В будущем не исключено и терапевтическое ис­пользование дцРНК. Решение проблемы их дос­тавки в определенные органы должно иметь огром­ное значение при заболеваниях человека, создавая возможность избирательного подавления экспрес­сии вредных генов при раке и ряде эндокринных расстройств, связанных с повышенной активно­стью того или иного гена.