Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Лабораторная диагностика вирусных инфекций          

Laboratory Tests fbr Viral Infections

Прямые методы: культура вируса, исследование антигена р24, ПЦР.

Непрямые методы: иммуноферментный анализ (ИФА), твердофазный иммуносорбентный анализ с ферментной меткой (ТИФА), иммуноблоттинг (WB, вестерн-блоттинг), непрямой иммунофлуо- ресцентный анализ (НИФА), метод радиоиммунопреципитации (РИП).

 Культуры вируса

•  Инокуляция животных и яиц была вытеснена клеточной культурой.
•  Стандартная вирусная пробирочная культура, выявляющая типичные цитопатологические из­менения, является золотым стандартом для доказательства этиологии, но методика может по­требовать от 10 дней до нескольких недель и имеет ограниченный предел определяемых вирусов. Используют клеточный материал животного (например, почки обезьяны, кролика) или человека (например, фибробласты, HeLa, клетки крови). Культура должа быть подтверждена гемадсорб- цией (например, вирусы гриппа, парагриппа, свинки) или методом флуоресцирующих антител (МФА). Вытяжка культуры вируса должна быть подтверждена МФА для определения специфич­ного антигена (например, ЦМВ, ВПГ, вирус ветряной оспы, респираторные и энтеровирусы). Ре­зультат известен уже в 1-2-й день.
•  Некоторые вирусы не могут быть культивированы и требуют других методов определения или специальных технологий (например, аренавирусы, астровирус, калицивирус, коронавирусы, ви­рус Коксаки типа А, флавивирусы, филовирус, вирусы гепатита А — Е, вирус Ласса, контагиоз­ный моллюск, норавирус, папилломавирусы, парвовирусы, полиомавирус, вирус бешенства, ро­тавирусы).
•  Выявление энтеровируса в фекалиях предполагает диагноз, но не доказывает, что именно этот вирус стал причиной заболевания (например, асептический менингит, миоперикардит).
•  Некоторые вирусы у асимптомных лиц присутствуют в течение нескольких месяцев (например, аденовирусы, ВПГ, ЦМВ), и это не свидетельство заболевания. Однако для других вирусов это не характерно: их наличие указывает на начало заболевания (например, корь, свинка, грипп, па­рагрипп, РСВ).
•  Дерево и хлопок токсичны для вирусов, поэтому их не используют в образцах для культивации.

Методы определения антигенов

Дают диагностику в течение нескольких часов. Не требуются жизнеспособные вирусы.

Прямое определение вирусных антигенов путем прямой РИФ, НИФА, ИФА (имеются коммерче­ские наборы для РСВ, ротавируса, аденовируса, вируса гриппа А, ВПГ) и комплекты для агглю­тинации (на ротавирус)

БОЛЕЗНИ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ

•  Респираторный тракт (отделы назофарингеальный, трахеальный, БАЛЖ) (например, аденови­рус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус гриппа А и В, вирус парагриппа, кори, риновирус, вирус ветряной оспы, ВПГ, энтеровирус).
•  Конъюнктива/роговица (например, аденовирус, ВПГ).
•  Фекалии (например, аденовирус [кишечные серотипы], ротавирус).
•  Моча: ЦМВ, паротита, аденовирус. Повышенная чувствительность при использовании несколь­ких образцов.

Эффективный метод при паротитном энцефалите если другие участки негативные

•  Кровь (вирус гепатита В, ВИЧ [р24], арбовирус, энтеровирус).
•  Лейкоциты периферической крови (например, ЦМВ ррбб).
•  Ткани: легкие (ЦМВ, грипп, аденовирус) и головной мозг (ВПГ) наиболее продуктивны для ис­следования антител.
•  ЦСЖ: анализы амплификации нуклеиновой кислоты самые надежные для выявления вирусов герпеса.
•  Кожа (например, ВПГ, ВВО).

 Выявление нуклеиновой кислоты в усиленных специфичных последовательностях ДНК. Ис­пользуют для вирусов РНК (например, ВИЧ, вирус гепатита С, РСВ, энтеровирус, вирусы гриппа и парагриппа, ротавирус и т.д.). ПЦР особенно эффективна для медленно растущих, нежизне­способных вирусов или при малодоступном количестве биоматериала

•  Сыворотка (например, HBV, парвовирус В19).
•  Плазма (например, РНК ВИЧ, HCV [качественный и количественный], ЦМВ).
•  Лейкоциты (например, вирус Эпштейна — Барр, ЦМВ, ДНК ВИЧ у младенцев или инфициро­ванных матерей).
•  Амниотическая жидкость (например, парвовирус В19).
•  ЦСЖ (например, ВПГ, ЦМВ, энтеровирусы, ВВО, вирус Эпштейна — Барр, полиомавирус).
•  Глазная жидкость (например, ВПГ, ВВО, ЦМВ).
•  Выделения из половых органов (например, палилломавирус).
•  Слюна (например, ВИЧ).

 Электронная микроскопия (ЭМ): используют для идентификации вирусных антигенов в тка­нях пациента (например, биопсия мозга на ВПГ при энцефалитах или вирус Якоба — Крейтцфельда) или других образцах материала (например, моча на ЦМВ при врожденных инфекциях новорожденных; фекалии на ротавирусы, вирусы Норфолк, аденовирусы, коронавирусы, кали- цивирусы; содержимое везикул на ВПГ и поксвирусы). ЭМ очень часто усиливают другими тех­нологиями (например, реакцией связывания антител).

 Световая микроскопия выявляет внутриядерные включения (например, ВПГ, ВВО, ЦМВ, аде­новирус, вирус кори) и цитоплазматические (например, ЦМВ, вирусы кори, бешенства).

Цитология

•  ВПЧ: коилоциты, другие изменения в Рар-мазке шейки матки, респираторные образцы материа­ла и образцы мочи.
•  ВПГ, ВВО: мазок по Тцанку.
•  ЦМВ: ядро в виде глаза совы в гинекологических, респираторных и образцах мочи.
•  ВПЧ: цитологические изменения в образцах гинекологических, респираторных и мочи.
•  Полиомные вирусы: в осадке мочи обнаруживают внутриядерные включения.
•  Molluscum contagiosum: соскобы с кожи и половых органов.

Другие включения (например, вирус кори; аденовирусы, РСВ); идентификация вируса может быть подтверждена МФА и специфичным иммуноферментным аятительным окрашиванием мазка.

Гистология

 Включения в биоптате или аутоптате — золотой стандарт диагностики выраженной цитомегало- вирусной инфекции. Метод расширен иммуноцитохимией; in situ проводят гибридизацию для определения специфичной нуклеиновой кислоты и ПЦР.

 Серодиагностика

 Доказательство свежей инфекции может быть основано на следующих фактах

•  Сероконверсия от негативной до позитивной или 4-кратный подъем титра антител в парных сыворотках, взятых с интервалом 2-4 недели, — диагностический признак свежей инфекции, но обычно слишком поздний для отдельного случая. Парные сыворотки следует всегда брать при подозрении на вирусное заболевание; сыворотка острой фазы заболевания должна быть получена как можно раньше. Некоторыми исключениями являются анамнестические реакции, перекрест­ные реакции с родственными антигенами; некоторые специфичные исключения (например, вы­сокий титр антител к ЦМВ при гриппе типа А или инфекциях, вызванных Mycoplasma pneumoniae).
•  Единичные образцы сыворотки, в которых на ранних стадиях инфекции выявляют специфич­ные антитела IgM (например, вирус Эпштейна — Барр, ЦМВ, ВВО, краснуха, паротит, корь, кок- сакивирус, бешенство, тропическая лихорадка, ВИЧ, HTLV—I и -II, вирусы гепатита от А до Е).
•  Необходимо помнить об исключениях:

IgM-ответ может быть преходящим, слабым или отсутствовать, ограничивая применение данного метода при таких, например, заболеваниях, как корь, паротит, Mycoplasma pneumoniae;

некоторые могут возникать и после исчезновения при реактивации или реинфекции (например, ВПГ, ЦМВ, ВВО вирус Эпштейна — Барр);

некоторые антитела могут персистировать 3= 6 месяцев (например, ЦМВ, краснуха);

гетеротипичный ответ выработкой антител к одному вирусу при инфекции, вызванной другим (на­пример, ЦМВ, вирус Эпштейна — Барр).

•  Ложно-позитивные титры часто возникают в сыворотке, содержащей ревматоидный фактор.
• Ложные результаты могут также развиваться и при других состояниях (например, подострый бактериальный эндокардит, хронические болезни печени, туберкулез, саркоидоз, а также у неко­торых здоровых лиц).
•  Ложно-негативные титры могут наблюдаться у иммунокомпрометированных пациентов, ново­рожденных, младенцев.

 Определение иммунного статуса (например, вирус Эпштейна — Барр, ВПГ, краснуха, корь, ви­рус гепатита А, анти-HBs, парвовирус В19).

 Для диагностики врожденной инфекции берут серийные сыворотки и от матери, и от ребенка

•  Уровень антител младенца, пассивно приобретенных трансплацентарно, выраженно снижаются к 2—3-му месяцу; неизменяемый уровень или повышение титра — свидетельство активной инфекции, хотя материнские антитела к ВИЧ могут персистировать у младенца < 18 месяцев.
•  Специфичные IgM в неонатальной или пуповинной крови могут указывать на врожденную ин­фекцию, поскольку IgM не пересекают плацентарного барьера.
•  Единичный отрицательный результат материнской сыворотки на IgG может быть полезен для исключения отдельной врожденной инфекции (например, краснуха, ЦМВ).
•  Положительный неизменный титр IgG указывает на перенесенную инфекцию и практически всегда — на сформировавшийся иммунитет.

Диагностика иммунного статуса может быть использована для определения вируса краснухи (у жен­щин детородного возраста), ЦМВ (у женщин детородного возраста, работающих в условиях высо­кого риска инфицирования [например, гемодиализ, трансплантология, педиатрия или детские дома]), кори, паротита, ветрянки (оспы), HAV (IgG), HBV (анти-HBs), вируса Эпштейна Барр, ВПГ, парвовируса В19

•  Предпочтительнее клеточной культуры, на которой вирус не растет хорошо (например, красну ха, вируса Эпштейна — Барр) или культивация опасна.