Лабораторные специализированные исследования, выполня­емые при врожденных нарушениях метаболизма

Лабораторные специализированные исследования, выполня­емые при ВНОВ. Большинство из нижеперечисленных тестов доступны в лабораториях многих крупных больниц. Данную группу исследований мы относим к тестам второй линии. Обычно они выполняются с целью определения конкретного диагноза или специфики нарушений, выявленных в предыдущих тестах.

1.  Молочная кислота и уровень соотношения лактат—пируват. Определение уровней лактата и пирувата необходимо для проведения диагностики у пациентов с тяжелым мета­болическим ацидозом. При выраженном повышении уров­ня лактата необходимо провести расчет анионной разницы . Исследование уровня молочной кис­лоты лучше проводить из образца крови, взятого из катете­ра, установленного в центральную вену, или из образца ар­териальной крови. Это объясняется тем, что даже незначи­тельный застой крови (венозная кровь, забранная после наложения жгута) может привести к значительному увели­чению уровня лактата. Соотношение лактат-пируват (в нор­ме 15-20) при дефиците пируватдегидрогеназы и дефектах глюконеогенеза (гликогенозы) не повышается. При дефи­ците декарбоксилазы, митохондриальных дефектах дыхательной/электронтранспортной цепи повышается больше чем в 25 раз.
2.  Аминокислотный анализ. Для того чтобы помочь в диагнос­тике ВНОВ, проводимый аминокислотный анализ должен быть количественным. При обследовании новорожденных, как правило, не показан аминокислотный анализ мочи. В неонатологии имеется лишь несколько показаний для вы­полнения данного теста: исключение цистинурии на фоне мочекаменной болезни, демонстрации высокого уровня по­чечного глицина, при подозрении на некетонную гиперглицинемию (см. пункт VI, Б, 3). Плазменный уровень амино­кислот предпочтительно оценивать (образец должен быть получен после 4-часового голодания), концентрируя вни­мание на некоторых нарушениях сразу, а не на одном ано­мальном значении, которое может являться результатом питания или артефактом (например, уровень таурина часто увеличивается при задержке анализа образца). Обсуждение множества существующих диагностических моделей иссле­дования плазменного уровня аминокислот выходит за рамки данного руководства. Интерпретация результатов должна проводиться опытными биохимиками и генетиками, знаю­щими клинические проявления и питание обследуемого па­циента.
3. Плазменный аминокислотный анализ выполняется не только при классических проявлениях ВНОВ, развившихся на фоне нарушения метаболизма аминокислот (напри­мер, болезнь «кленового сиропа» и ФКУ), но и помогает выя­вить дефекты цикла мочевины, поскольку в цикле мочевины химически можно выявить несколько аминокислот (напри­мер, цитруллин, аргинин, орнитин). При гипераммониемии также повышен уровень глутамина (синтез глутамина включает в себя аммиак). По крайней мере должно быть получено 1-2 мл крови. Для проведения полноценного лабораторного исследования используют ге- паринизированную кровь или образцы без добавок. Образ­цы должны быть направлены в лабораторию во льду. Если анализ будет перенесен на более позднее время, кровь долж­на быть центрифугирована с целью отделения плазмы, ко­торую необходимо заморозить.
4. Анализ мочи на выявление органических кислот. Данный комплекс аналитических исследований, как правило, вы­полняется в лабораториях, специализирующихся на биохи­мической генетике. В опытных руках этот тест может дать огромное количество информации. Анализ мочи на выявле­ние органических кислот помогает установить диагноз орга­нической ацидемии. Наиболее распространены метилмало­новая ацидемия, пропионовая ацидемия и изовалериановая ацидемия (см. пункт VI, Б, 5). Большинство лабораторий запрашивают для проведения данного исследования по мень­шей мере 5—10 мл «свежей» мочи. Как только образец будет собран, он должен быть либо перевезен в лабораторию во льду, либо заморожен при температуре —20 °С.
5.  Сукцинилацетон в моче. Данный тест является специфи­ческим для выявления гепаторенальной тирозинемии. Обра­зец собирается и используется для исследования на мокрой фильтровальной бумаге (как это выполняется при рутин­ных скрининг-тестах новорожденных). После сушки на воз­духе образец перенаправляют для тестирования в лаборато­рию по почте или курьерской службой.
6. Ацилкарнитиновый профиль. Жирные кислоты метаболизируются в митохондриях и с целью облегчения их транспор­та в митохондрии конъюгируются с карнитином. Ацил-карнитиновый профиль определяет уровни метаболитов жир­ных кислот различной углеродной длины с учетом признания диагностических паттернов для различных жирных кислот, выявления дефектов оксиления. Отметим, что длинноцепо­чечные жирные кислоты с углеродными цепями 24 и более метаболизируются в пероксисомах (см. пункт XII, В, 8). Ацил-карнитиновый профиль в настоящее время часто оце­нивается как часть необходимого обследования новорож­денных при тандемной масс-спектрометрии; альтернативное испытание проводится врачами-генетиками в биохимичес­ких лабораториях. Для исследования используются высу­шенные образцы цельной крови, размещенные на фильтро­вальной бумаге. Дополнительные исследования необходи­мы для пациентов с подозрением на дефект окисления жирных кислот. Проводится определение общего и свобод­ного карнитина в плазме крови (измеряется в геиаринизи- рованной крови).
7. Тандемная масс-спектрометрия (ТМС). ТМС позволяет вы­явить большое количество нарушений метаболизма амино- и органических кислот, а также дефектов окисления жир­ных кислот. Данная методика является ценным инструмен­том для обследования новорожденных. ТМС в настоящее время используется в большинстве скрининг-программ для выявления метаболических нарушений у новорожденных. Многие лаборатории также принимают образцы крови, по­лученные вне пределов неонатального периода от детей с симптомами, указывающими на наличие ВНОВ. Тестиро­вание легко выполнимо (точечные пробы крови отправля­ются в лабораторию по почте), что обычно весьма рента­бельно.
8. Исследования при галактоземии. Для определения уровня галактоза-1-фосфата и активности галактоземии, как пра­вило, по просьбе лаборатории, на исследование подается цельная кровь, поскольку метаболиты и ферменты локали­зованы именно в эритроцитах. Кровь должна быть получена до переливания крови. Если альтернативное переливание крови уже было выполнено, можно провести исследование крови гетерозиготных родителей пациента, так как у гете­розигот также можно провести ферментативный анализ.
9. Исследование пероксисомальной функции. Исследование уровня длинноцепочечных жирных кислот осуществляется с помощью метода газовой хроматографии. Как правило, определяются только следовые количества жирных кислот с 24-углеродной цепью и более. Измерение, следовательно, позволяет обнаружить все пероксисомальные нарушения, влияющие на деградацию этих соединений. Отметим, что уровень длинноцепочечных жирных кислот в небольшой подгруппе пациентов с пероксисомальными дефектами бу­дет в пределах нормы (например, при точечной ризомиели- ческой хондродисплазии). Иногда необходим тест — оценка других аспектов пероксисомальной функции (например, плазмалогены, фитановая кислота, или измерения пипеко- лической кислоты). Большинство из этих анализов выпол­няется на образце крови с ЭДТА. Осадок из красных кровя­ных клеток (отсепарированный) также должен быть переданв лабораторию, так как плазмалогенные уровни оценивают­ся именно из клеток красной крови. Образцы не должны быть заморожены.
10. Анализ электрофореза трансферрина проводится при подо­зрении на синдром карбогидрат-дефицитных гликопротеи­нов (одной из редких форм лизосомных болезней накопления) и является исследованием первой ли­нии. Проведение электрофореза позволяет провести анализ гликопротеина, как правило, трансферрина. Измерение уров­ня трансферрина неуместно в качестве диагностического тес­та для вышеперечисленных условий (уровни обычно в преде­лах нормы). Участие генетика в подобной ситуации необходи­мо для проведения электрофореза, т. к. не у всех пациентов выявляются отклонения и требуется назначение дальнейше­го специализированного тестирования.
11. Выполнение биопсии скелетных мышц может потребовать­ся у пациентов с молочнокислым ацидозом для установле­ния диагноза дефекта митохондрий дыхательной цепи. Необ­ходимы также электронная микроскопия, специальная окраска и ферментные пробы. Некоторые ВНОВ требуют определения активности ферментов в культурах фиброблас­тов кожи. При расстройствах обмена гликогена может по­требоваться выполнение биопсии печени, что позволяет установить точный диагноз.
12. Анализ ДНК-секвенирования. Молекулярные дефекты в настоящее время вызывают многие генетические заболева­ния, в том числе ВНОВ. Диагноз, как правило, устанавли­вается путем проведения биохимического исследования, анализа геномной или митохондриальной ДНК. Учитывая сложность выполнения данных испытаний и высокую стои­мость, анализ ДНК обычно проводится только под руковод­ством опытного генетика. Обсуждение особенностей иссле­дования выходит за рамки данного руководства.